Terapia Génica posible en Enfermedades Autoinmumes

 Células de médula ósea se recogieron a partir de ratones donantes varones, que había recibido el 5-fluorouracilo 3 días antes, y transducidas con  interleucina 1 (IL-1) antagonista del receptor (IL-1Ra) o un gen simulado usando un vector de retrovirus. Después de la confirmación de que las células transducidas poseía el transgén en aproximadamente 0,7 copias por célula y secretaban recombinante IL-1Ra, fueron estas células infundidas en hembras receptoras subletalmente irradiados (6 Gy) una vez al día durante 4 días consecutivos. Estos ratones receptores mujeres tenían el antígeno Y, los hombres en la médula ósea, el hígado y el bazo, y el 10% a 20% de las células del bazo poseía el transgén hasta 8 semanas después del trasplante. La glomerulonefritis fue inducida a continuación, en estos ratones. La función renal y la histología retardada en la médula ósea de ratón se reconstituyó con células productoras de IL-1Ra en comparación con los simulacros de las células transducidas. 

La hibridación in situ con la sonda de pintura Y Reveló que se trasplantaron células de donantes reclutadas en el glomérulo a la inducción de la nefritis, lo que sugiere efectos terapéuticos fueron canalizados a través de la secreción de IL-1Ra partir de estas células. Por otra parte, la tasa de supervivencia después de un segundo desafío con el anticuerpo nefrotóxico mejoró significativamente en la quimera de IL-1Ra. Estos resultados sugieren que la reconstitución de la médula ósea cómo suministro continuo de ceúlas antiinflamatorias puede ser una estrategia útil para el tratamiento de la inflamación crónica.

Referencias:
http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/98/1/57.short 

Células Madre ayudan en Síndrome de Goodpasture

En ratones en los que se provocó una lesión alveolar extensa con el uso de bleomicina, se observó la regeneración de nuevos neumocitos, después de la administración intravenosa de células hematopoyéticas procedentes de la médula ósea. Otros autores también han comprobado experimentalmente la regeneración de neumocitos en pulmones con lesiones alveolares extensas.

En experimentos con animales se ha demostrado que la administración de células de la médula ósea genéticamente modificadas pueden aportar factores antinflamatorios y suprimir el daño renal en ratones con el síndrome de Goodpasture.

Se han comunicado resultados satisfactorios con la utilización de túbulos renales bioartificiales en que se emplean células progenitoras epiteliales sobre membranas de fibra hueca que son permeables, tanto al agua como a los solutos. Este sistema de filtración se ha empleado como un aditamento extracorpóreo para el tratamiento de la insuficiencia renal crónica en animales de experimentación y se han comunicado algunas experiencias con resultados alentadores en pacientes con daños renales.

 Referencias:

http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol22_1_06/hih02106.htm 

Clonación, Avances en el Comprendimiento de la Enfermedad

Se han realizado estudios acerca de las membranas basales glomerulares (GMB) en varios mamíferos.El colágeno tipo IV es un protómero de triple hélice que se auto-ensambla a en su extremo N-terminal (dominio 7S) para formar tetrámeros ya través de su dominio C-terminal no colágeno (NC1). Las secuencias que constituyen las cadenas α1 y α2 del protómero fueron decodificadas por medio de clonación.   

Utilizando la clonación molecular, se aisló un ADNc contenía los 32 residuos del monómero M2 * que codifica y 471 residuos de la cadena α3. Los fragmentos de la cadena humana α3 fueron clonados estructura primaria completa de la cadena humana α3 se determinó. En general, estos estudios establecieron la existencia de la cadena α3 y su identidad con el autoantígeno GP. Los resultados de una secuencia parcial de cDNA que codifican la cadena bovina α4 y un clon de cDNA de longitud completa que codifica la cadena humana α4  más verificó la existencia de la cadena α4.

 

Refencias

http://jasn.asnjournals.org/content/15/10/2514.short 

Uso de Transgénicos

Se ha desarrollado un modelo transgénico anti-a3 (IV) NC1 del colágeno Ig,. El modelo de Ig transgénico es útil para estudiar la tolerancia de células B. Implicando la identificación de un anticuerpo anti-alpha3 (IV) NC1 anticuerpo monoclonal (AcMo) que se une a un epítopo patógeno, la clonación del anticuerpo genes H y L de cadena y las secuencias reguladoras, la generación de Ig H + L ratones Tg, y la evaluación del fenotipo resultante células B. El transgénico de células B del receptor en este modelo se dirige a un epítopo reconocido por colágeno patógeno de IgG en los sueros de los pacientes GPS. El análisis del destino de las células B Tg indica que las células reactivas del colágeno son tolerantes y no ignorantes inmunológicamente. La eliminación de anticuerpos endógenos (no-Tg) y las células T mediante la creación de ratones Tg con deficiencia de activador de recombinación genética (GAR) conduce al agotamiento casi completo de Ig y células B que es evidente en la médula ósea, así como el bazo. En conjunto, estos resultados indican que las células anti-alpha3 (IV) NC1 se regulan in vivo, sugiriendo que los epítopos reactivos están expuestos y que ambos (alpha3 (IV) NC1 colágeno o una reacción cruzada auto-antígeno) es tolerogénico. La tolerancia central en la deficiencia de Rag-Ig ratones Tg indica además que tolerógeno se encuentra en la médula ósea.

 

B cell surface transgene expression of spleen (A, B) and bone marrow (C, D) from Rag enzyme sufficient (A, C) and Rag-deficient (B, D) B6 mice. Shown are representative dot plots of log fluorescence data for stained unstimulated cells gated on lymphocytes on the basis of forward and side scatter. Mouse genotypes include mice lacking the Tg (Non-Tg), mice hemizygous for both H and L chain Tg (Tg), mice sufficient in Rag enzyme (Rag+), and mice homozygous for Rag enzyme deficiency (Rag-). Cells were stained with PE or PerCP conjugated anti-B220 and FITC or PE labeled anti-IgM, anti-IgMa, or anti-IgMb. The Tg H chain is IgMa-allotype, whereas B6 mice endogenously express only IgMb.

Referencias

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2597645/

ADN recombinante ( Síndrome Goodpasture)

Los protocolos para la obtención del antígeno humano puro son laboriosos y de bajo rendimiento y requieren riñones de cadáveres. El Recombinante alfa 3 (IV) NC1 producida en E. coli ha sido insoluble y mal reconocida por autoanticuerpos de los pacientes. Se ha utilizado el sistema de expresión de baculovirus para producir el antígeno como un producto soluble en células Sf9. Un vector de transferencia se construye a partir de ADNc que codifican el péptido líder, terminal NH2 y 7 S dominio de la alfa humana 1 cadena de colágeno tipo IV y se unió inframe al dominio NC1 y extremo COOH de la cadena alfa humana 3 bajo el control de el promotor de la polihedrina. Esto  codifica una cadena híbrida "mini"-colágena de la que ha sido la mayoría de la región central helicoidal triple eliminada. 

El antígeno recombinante se ve en la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y las transferencias Western de sobrenadantes a su tamaño molecular predicho de 41 kDa y como dímeros de 82 kDa. 
No reaccionaron fuertemente con anticuerpos humanos por parte de
inmunoensayo Western Blot. La enzima ligada, inhibió la unión de autoanticuerpos a GBM humano, y ató dos anticuerpos monoclonales conocidos a reconocer la alfa 3 (IV) NC1. 
Estas moléculas recombinantes deben resultar muy valiosas para el estudio in vitro de la inmunopatogénesis de la enfermedad de Goodpasture, y el enfoque proporciona un medio por el cual las interacciones entre las cadenas de tipo diferentes de colágeno IV que se encuentran en GBM podría ser estudiado in vitro

Referencias: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8006020 

Mecanismos moleculares del Síndrome Goodpasture

El síndrome de Goodpasture es un trastorno multigénico. Hudson y sus colegas identificaron dominio el a3 (IV) NC1 como el autoantígeno de Goodpasture. Este antígeno diana debe estar presente como un componente de la red nativa a3.a4.a5 (IV)  de las membranas basales seleccionadas a fin de que la enfermedad pulmonar y renal se desarrolla.
En ratones, la inducción del síndrome de anti-glomerular de Goodpasture en seres humanos está restringido por los alelos MHC; HLA-DRB1 * 1501 y DRB1 * 1502 con susceptibilidad en aumento, mientras que el HLA-DR7 y DR1 son protectores. El timo expresa A3 (IV) NC1 péptidos que pueden causar la eliminación de las células autorreactivas CD4 +  y células T helper, pero unas pocas células T  escapan a la eliminación y, posteriormente crean la producción de anticuerpos anti-membrana basal. La inmunología específica de los anticuerpos es notable, ya que los anticuerpos contra a1.a1.a2 (IV) NC1 dominios no causan la nefritis anti-membrana basal glomerular.

Referencias: 

http://medres.med.ucla.edu/Education/syllabus/Nephrology/pdf/Alport%27s%20Synd,%20Goodpasture%27s%20Synd%20%26

%20Type%20IV%20Collagen.pdf 

Otras técnicas moleculares (Diagnóstico)

El estudio de inmunofluorescencia en tejido pulmonar requiere disponer de tejido en fresco. Por tanto, es necesario congelar un fragmento de parénquima pulmonar para realizar la técnica de inmunofluorescencia frente a IgA, IgG, IgM, las fracciones de complemento C3, C4 y C1q y frente a fibrinógeno y albúmina.

Detección de anticuerpos antiMB de las paredes septales, que se pueden detectar mediante ELISA específica en muestras de suero o, como se realiza en algunos laboratorios de referencia, por radioinmunoensayo. El principio de la técnica es recubrir componentes de la membrana basal purificados que han sido digeridos con colagenasa (o con péptidos NC1_31V) en un soporte en fase sólida como las placas de microtitulación de plástico. Se aplica el suero y los anticuerpos antimembrana basal se unen a los componentes de la membrana basal. Dicha unión se detecta después con reactivos anti-IgG humanos marcados con un agente de marcaje.

Referencias

http://www.medigraphic.com/pdfs/neumo/nt-2006/nt064e.pdf